ความโศกเศร้าอย่างยิ่งต่อการสูญเสียพระสวามีทำให้อิซาเบลหั่นพระเกษา สวมเสื้อผ้าไว้ทุกข์ และสวมผ้าคลุมผมหนา ทรงใช้ชีวิตอย่างเงียบๆ และอุทิศชีวิตให้กับการสวดมนต์ พระองค์เชื่อว่าการสิ้นพระชนม์ของพระสามีเป็นสัญญาณเตือนจากพระเจ้าซึ่งไม่พอใจที่โปรตุเกสเปิดให้ชาวยิวที่พระราชบิดามารดาของพระองค์ขับไล่ออกจากสเปนเข้าไปลี้ภัย พระองค์ยึดหลักการอดอาหารและบำเพ็ญทุกรกิริยาอย่างหนักเพื่อไถ่บาป ทั้งยังปฏิญาณว่าจะไม่สมรสใหม่ ทว่าพระเจ้าเฟร์นันโดและพระราชินีอิซาเบลประสงค์ให้พระราชธิดาคนโตสมรสใหม่กับมานูแวล ทายาทคนใหม่ในบัลลังก์โปรตุเกสซึ่งเคยเจอเจ้าหญิงอิซาเบลในช่วงที่ทรงพำนักอยู่ในโปรตุเกสและถูกตาต้องใจพระองค์

ในปี ค.ศ. 1497 พระราชบิดามารดาได้เสนอให้พระองค์สมรสกับพระเจ้ามานูแวลที่ 1 ซึ่งได้ขึ้นสืบทอดบัลลังก์โปรตุเกส แม้จะปฏิเสธในตอนแรก แต่สุดท้ายพระองค์ไม่อาจฝืนแรงกดดันจากพระบิดามารดาได้ ในปี ค.ศ. 1496 พระองค์ตกลงสมรสกับพระเจ้ามานูเแวลที่ 1 แห่งโปรตุเกสโดยมีเงื่อนไขว่ากษัตริย์ต้องขับไล่ชาวยิวทั้งหมดออกจากโปรตุเกส พระเจ้ามานูแวลตกลงทำตามเงื่อนไข สุดท้ายพระองค์กับเจ้าหญิงอิซาเบลได้อภิเษกสมรสกันที่เมืองบาเลนเซียเดอัลกันตาราในวันที่ 30 กันยายน หลังพิธีสมรสอิซาเบลได้ติดตามพระสวามีเดินทางกลับโปรตุเกสในฐานะสมเด็จพระราชินี

ในวันที่ 6 ตุลาคม ค.ศ. 1497 ฆวน เจ้าชายแห่งอัสตูเรียส พระอนุชาของพระนางอิซาเบลสิ้นพระชนม์ พระองค์จึงกลายเป็นรัชทายาทในบัลลังก์กัสติยา พระราชบิดามารดาของอิซาเบลได้เชิญพระองค์และพระสวามีมาที่สเปน กษัตริย์และพระราชินีแห่งโปรตุเกสเดินทางออกจากกรุงลิสบอนในช่วงปลายเดือนมีนาคม ค.ศ. 1498 และเดินทางถึงกรุงโตเลโดในวันที่ 24 เมษายนเพื่อรับการถวายคำสัตย์ปฏิญาณแห่งความจงรักภักดีจากขุนนางกัสติยา ทั้งคู่เดินทางต่อและไปถึงกรุงซาราโกซาในวันที่ 1 มิถุนายน เพื่อรับการถวายคำสัตย์ปฏิญาณแห่งความจงรักภักดีจากขุนนางอารากอน แต่กระบวนการไม่ราบรื่นอย่างที่คิดเนื่องจากกฎหมายอารากอนจำกัดสิทธิ์ในการสืบทอดตำแหน่งของทายาทหญิง โดยไม่ให้คู่สมรสขึ้นเป็นกษัตริย์ร่วมแห่งอารากอน ขุนนางอารากอนจึงไม่เต็มใจถวายคำสัตย์ปฏิญาณต่อพระเจ้ามานูแวล